Auftragsanalytik: N-terminale Proteinsequenzierung

N-terminale Edman Proteinsequenzierung

Wir bieten
die N-terminale Sequenzierung von Proteinen und Peptiden für lyophilisierte, flüssige und an PVDF-Membranen gebundene Proben als Auftragsanalytik an. Je nach Menge an Protein und Peptid und Anforderung können typischerweise 5 bis 40 Aminosäurereste durch N-terminale Sequenzierung bestimmt werden.

Sie erhalten
einen Ergebnisreport der N-terminalen Proteinsequenzierung mit Angabe der detektierten Aminosäure-Sequenz und die zugehörigen HPLC-Chromatogramme in elektronischer Form per email oder über einen unserer SSL und Passwort geschützten Web-Server.


N-terminale Proteinsequenzierung mit Procise Edman Sequenzer

Anwendungsbereich N-terminale Proteinsequenzierung

Bestimmung des N-Terminus eines Proteins oder Proteinfragments
Bestimmung des N-Terminus eines Peptids
Kontrolle der korrekten Translation eines rekombinanten Proteins
Kontrolle der Sequenz und Reinheit eines synthetischen Peptides
Kontrolle der Sequenz und Reinheit eines Proteins
Komplettsequenzierung eines Proteins in Kombination mit weiteren Methoden
Qualitätskontrolle
Identifizierung von Proteinen und Peptiden



Wie können Sie die N-terminale Proteinsequenzierung Ihrer Probe beauftragen?
Bitte kontaktieren Sie uns im Vorfeld und schicken Sie Ihre Protein- oder Peptidprobe zusammen mit unserem Edman Sequenzierungsformular an uns. Unten finden Sie weitere Informationen bezüglich der Anforderungen an die Proben und den Versand der Proben.


 
 
 

Anforderungen an Protein- und Peptidproben

Probenmenge  mind. 20 pmol, geringere Mengen werden nur nach Rücksprache akzeptiert!  
Probenform  1. Lyophilisierte Protein/Peptid Proben
2. Flüssige Protein/Peptid Proben in 10-100µl flüchtigem Lösungsmittel wie Wasser, (Iso-)Propanol, Acetonitril. Die Proben muss gefroren verschickt werden!
3. Auf PVDF-Membran geblottete Proteinprobe (Proteinbandengröße: max. 3x6 mm, besser kleiner und konzentrierter). Die Proteinbande kann mit Ponceau S, Amino black, Sulforhodamin oder Coomassie Brilliant Blue angefärbt sein.  
Reinheit   Die Probe sollte so rein wie möglich sein (>75-80% Reinheit) und nur ein Protein oder Peptid enthalten. Freie Aminosäuren, primäre Amine, SDS, Salze, Buffer und andere Kontaminaten sollten möglichst von der Proteinprobe entfernt sein, da diese Verunreinigungen die Edmanchemie und Detektion der PTH-Aminosäuren negative beeinflussen und das Analysengerät kontaminieren können.  
Cystein Modifikation  Nicht modifiziertes Cystein kann bei der N-terminalen Sequenzierung nicht detektiert werden. Deshalb muss die Probe im Vorfeld modifiziert werden, wenn Sie den Nachweis von Cystein wünschen. Eine Modifikationsprozedur ist unten beschrieben. 
N-terminale Blockierung   Proteine und Peptide, die N-terminal blockiert sind, verfügen über keine freie N-terminal Aminogruppe und können deshalb nicht sequenziert werden. Dies trifft auf über 50% aller eukaryontischen Proteine zu. Auf Anfrage können wir Deblockierungsmethoden einsetzten, die jedoch eine signifikant höhere Proteinmenge erfordern und nicht in jedem Fall funktionieren, da die Art der Blockierung oft nicht bekannt ist.  
Glykosilierungen und andere Modifikationen  Edman Sequenzierzyklen ohne Detektion einer PTH-Aminosäure, reduzierte Peakintensitäten und veränderte Retentionszeiten können auf glykosilierte, phosphorylierte oder anders modifizierte Aminosäuren zurückgehen und eine Identifikation der jeweiligen Aminosäure unmöglich machen.  



Hinweise zum Probenversand an Proteome Factory

Füllen Sie bitte das Edmanprobenformular mit Informationen über die Proben aus (z.B. Probenname, Probentyp, MW, Proteinmenge, Färbungsmethode) und die gewünschte Anzahl an N-terminalen Sequenzierungsschritten. Unterzeichnen Sie das Formular.
Informieren Sie uns per email oder telephonisch, dass Sie Ihre Proben an uns schicken
Verpacken Sie Ihre Proben in Eppendorf-Reaktionsgefäßen, die Sie mit Parafilm umwickeln. Proteinproben auf PVDF-Membran können Sie entweder als ausgeschnittene und trockene PVDF-Proteinbande im Eppi an uns schicken oder als getrocknete angefärbte PVDF-Membran in einer Plastikhülle mit beiliegender Beschreibung/Beschriftung der zu analysierenden Proteinbande. Wir schneiden dann die gekennzeichnete Proteinbande für die Analyse aus.
Flüssige Proben versenden Sie bitte im gefrorenen Zustand
Lyophiliserte und auf PVDF-Membran geblottete Proben können Sie normalerweise bei Raumtemperatur verschicken.
Schicken Sie bitte Ihre Proben in einem wattierten Briefumschlag oder einem Päckchen zusammen mit dem Probenformular an uns.



Unsere Empfehlung zum Proteinblotting



Semidry PVDF-Blotting Protokoll

Wir empfehlen folgendes Protokoll für das Semidry Blotting auf PVDF-Membranen:

- PVDF-Membran: Immobilon P Membran

- Blot-Puffer: 50 mM Natriumborat, pH 9,0 / 20% Methanol (HPLC Qualität)
(0,1% SDS kann zum Blot-Puffer zugesetzt werden, wenn ein Protein, das über 40kDa groß ist, geblottet werden sollen.)

- Blotbedingungen: 1mA/cm2 PVDF Membran für 2-3 Stunden bei 4°C

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Proteinfärbung von PVDF-Membranen

Ponceau Rot Färbung

Färbelösung (0,5% Ponceau S, 1% Essigsäure in bidest. Wasser):

0,25 g Ponceau S
0,5 mL Essigsäure
ad 50 mL mit bidest. Wasser

Durchführung:
1. Der Blot wird nach dem Blotten 2x3 min mit reichlich bidest. Wasser gewaschen.
2. Die Ponceau-Färbung wird ca. 1-3 Minuten mit Färblösung durchgeführt. Das Entfärben wird unter visueller Kontrolle mit bidest. Wasser durchgeführt bis Proteinbanden gut sichtbar werden.
3. Membran trocknen.

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Sulforhodamin Färbung

Färbelösung (0,005% Sulforhodamin, 0,2% Essigsäure, 30% Methanol in bidest. Wasser):

150 mL Methanol
1 mL Essigsäure
25 mg Sulforhodamin
ad 500 mL mit bidest. Wasser

Durchführung:
1. Der PVDF-Blot wird nach dem Blotten 2x10 min mit reichlich bidest. Wasser gewaschen.
2. Die PVDF-Membran vollständig trocknen!
3. Membran 1-2 min in Färbelösung schwenken
4. Gefärbte Membran kurz in bidest. Wasser waschen.
5. Membran trocknen.

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CBB R250 Blotfärbung

Färbelösung (0,1% CBB R250, 10% Essigsäure, 40% Methanol in bidest. Wasser):

0,1 g CBB R250
40 mL Methanol
10 mL Essigsäure
ad 100 mL mit bidest. Wasser


Entfärbelösung (10% Essigsäure, 40% Methanol in bidest. Wasser):

40 mL Methanol
10 mL Essigsäure
ad 100 mL mit bidest. Wasser

Durchführung:
1. PVDF-Blot 5 min in Färbelösung schwenken
2. PVDF-Blot 3 x 5min in Entfärbelösung unter visueller Kontrolle schwenken, bis Proteinbanden gut zu erkennen sind und die Membran ausreichend entfärbt ist
3. Membran trocknen

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