Protein Biomarker Discovery & Proteomik

Proteomik Biomarker & Target Discovery

Die moderne Proteomik, auch Proteomanalyse genannt, ermöglicht die gleichzeitige quantitative Analyse von hunderten bis tausenden Proteinen in differentiellen Vergleichsexperimenten. Sie ist sehr hilfreich bei der Suche nach neuen potentiellen Biomarkern, sogenannten Durg Targets und Proteinen, die aufgrund von krankheits- und umweltassoziierten oder anderen intra- oder extrazellulären Veränderungen in ihrer Konzentration reguliert sind.
Die Proteomik kann entscheidene Informationen für eine verbesserte, effizientere und zielgerichtetere Entwicklung bei der Wirkstofffindung, den damit verbundenen Entwicklungsprozessen sowie der Entwicklung von Diagnostika für eine vielzahl von Krankheiten liefern.

Proteome Factory AG hat die umfangreiche PFA Proteomics Technologie Plattform aufgebaut und bietet seit vielen Jahren erfolgreich verschiedene Verfahren der Proteomik für die Biomarker- und Target-Findung an, die zum Teil komplementäre Bereiche des Proteoms abdecken. Neben gel-basierter Proteomik wie der extrem hochauflösenden 2D Elektrophorese (2DE) werden auch gel-freie Proteomanalysen auf Peptidebene mit ein- oder multi-dimensionaler Chromatographie gekoppelter Massenspektrometrie (1D-LC-ESI-MSMS oder 2D-LC-ESI-MSMS) routinemäßig durchgeführt. In Multiplex-Proteomanalysen werden die zu vergleichenden Proteinproben differentiell mit isobarischen oder Massen-Labeln wie MeCAT markiert, wodurch eine gleichzeitige relative Quantifikation von Peptiden und Proteinen in der massenspektrometrischen Analyse ermöglicht wird.

Die PFA Proteomics Technologie Plattform wird für alle Arten von proteinhaltigen Probenmaterialien eingesetzt, wie


Gewebe
Plasma, CSF oder andere Körperflüssigkeiten mit und ohne Proteinvorfraktionierung
Zellkultur
Mikroorganismen

2D Elektrophorese Protein Biomarker Discovery

Die Zielsetzung der differentiellen 2DE Proteomanalyse ist die Identifizierung und relative Quantifizierung von regulierten Proteinspots zwischen zwei oder mehr zu untersuchenden Probengruppen, z.B. krankheits-assoziierte vs. Kontroll, behandelte vs. unbehandelte Probengruppen oder dem Vergleich von verschiedenen Stämmen einer Spezies. Im letzteren Fall können z.B. bei Mikrooragnismen Rückschlüsse auf die Ursache einer erhöhten Pathogenität gewonnen werden oder potentielle Vakzin-Kandidaten identifiziert werden.

Die Proteome Factory AG setzt seit vielen Jahren sehr erfolgreich die extrem hochauflösende 2D Elektrophorese nach Kobalz und Klose, 1995 ein, die je nach Gelgröße (23x30 cm oder 40x30 cm) und Probenart eine Auftrennung von tausenden bis zu theoretischen 10000 Proteinspots ermöglicht und damit die weltweit leistungsfähigste Trenntechnik für Proteine in der sehr gut reproduzierbaren 2DE Routine der Proteome Factory AG ist.

Zur erfolgreichen Durchführung von Proteomanalysen ist geeignetes und gutes Probenmaterial Voraussetzung, das reproduzierbar gewonnen werden muss. Es gilt immer "garbage in = garbage out"! Wir beraten Sie gerne.
Für eine Proteomstudie empfehlen wir ein Minimum von drei bis fünf 2DE Gelen je gut definierter und homogener Probengruppen. In Abhängigkeit des zu untersuchenden biologischen Systems kann eine (deutlich) höhere Probenanzahl je Gruppe erforderlich sein, um statistisch signifikante Aussagen treffen zu können.

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2DE Proteomanalyse

Arbeitsschritte der 2DE Proteomanalyse

Adäquate Probennahme (beim Kunden/Kooperationspartner nach gemeinsamer Beratung)
Probenvorbereitung für 2DE mit Proteinextraktion und Proteinkonzentrationsbestimmung
Extrem hochauflösende 2D Elektrophorese aller Proben
Ggf. wird eine Vorfraktionierung der Proteine durchgeführt z.B. zur Abreicherung domainater Proteine aus Plasma oder CSF mittels Affinitätschromatographie
Hochsensitive MS kompatible FireSilver Silber- oder FireRuth Fluoreszentfärbung
Digitalisierung der gefärbten 2DE Gele
Differentielle 2DE Bildanalyse mit spezieller Software
Statistische Analyse zur Identifizierung regulierter Proteinspots (Mann-Whitney-Test etc.)
Spot-Picking und in-gel Verdau von (regulierten) Proteinspots
Proteinidentifizierung durch hochsensitive MSMS-Massenspektrometrie Verfahren
Optionale Validierung von Protein Targets mittels Selected Reaction Monitoring LC-ESI-MSMS


LC-MS Proteomik

Als Alternative zur gel-basierten Proteomanalyse wendet Proteome Factory gel-freie Proteomik an. Für differentielle Analysen werden dazu die zu vergleichenden Proteinproben mit isobarischen Markierungsreagenzien (iTRAQ™*) oder Massenmarkern markiert. Dies kann einerseits auf Peptidebene erfolgen oder wie beim MeCAT-Verfahren schon auf Proteinebene, wobei MeCAT oft in Verbindung mit Trennverfahren für Proteine eingesetzt wird.
iTRAQ™* ist ein isobarisches Markierungsreagenz, dass aus einer Reportergruppe (report group), einer Ausgleichsgruppe (balance group) und einer Peptid-reaktiven Gruppe (PRG) besteht. Es gibt vier verschiedenen Reagenzien, die in ihrer Masse identisch sind und sich durch in der Summe kompensierende Massenunterschiede zwischen der Reportergruppe und der Ausgleichgruppe aufgrund des Einbaus von 13C anstelle von 12C im Reporter bzw. der Ausgleichsgruppe unterscheiden. Die Masse der Reportergruppe liegt zwischen 114 und 117 Da und die jeweils korrespondierenden Masse der Ausgleichsgruppe zwischen 31 und 28 Da, so dass die Gesamtmasse jeweils gleich ist.
Die Peptid-reaktive Gruppe ermöglicht eine kovalente Kopplung an die Epsilon-Aminogruppe von Lysin und alle freien N-terminalen Aminogruppen von Peptiden. Proteolytische Verdaus von bis zu vier Proteinproben werden mit den verschienden iTRAQ™ Reagenzien markiert und anschließend für die LC-MS Analytik zu einer gemeinsamen Probe vereint. Die mit den vier verschiedenen iTRAQ™ Reagenzien markierten Peptide verhalten sich in der chromatographischen Trennung und MS Analyse identitisch, d.h. die jeweils korrespondierenden Peptide aus den vier Proben koeluieren. Erst bei MS/MS Fragmentierungsanalysen der Peptide wird das iTRAQ™ Reagenz fragmentiert. Die vier verschiedenen Reportergruppen der iTRAQ Reagenzien m/z 114, m/z 115, m/z 116 und m/z 117 können detektiert werden. Das Intensitätsverhältnis der Reportermassenpeaks spiegelt dabei die relative Menge an Peptid aus dem jeweils korrespondieren Verdau wieder und möglicht somit die relative differentielle Quantifizierung von Proteinen zwischen den bis zu vier Proteinproben.


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*iTRAQ™ ist ein Markenzeichen der Applera Corporation, Applied Biosystems und ihrer Tochterunternehmen.


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