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Absolute Quantifizierung und Validierung

Absolute Quantifizierung von Proteinen & Peptiden

Die absolute Quantifizierung von Proteinen, Peptiden, Isoformen und Punktmutationen in biologischen Proben oder Produkten wird zunehmend immer wichtiger. Sie wird einerseits zur Bestimmung der Menge/Konzentration spezifischer Proteine in Probenmaterialien benötigt und andererseits für eine effektive und zielgerichtete Validierung von Protein- und Peptid-Biomarker- und Target-Kandidaten. Im letzten Fall müssen zur Validierung der Biomarker- und Target-Kandidaten sehr große Probenpopulationen zielgerichtet untersucht werden, bei denen eine umfassendere Proteomanalyse 'overkill' und meist aus Kosten- und Zeitgründen nicht realisierbar wäre.
Oft ist es nur schwer möglich mittelfristig einen spezifischen ELISA oder immunologischen Quantifizierungstest aufzubauen. Neue Antikörper stehen erst nach vielen Monaten zur Verfügung und ihre Qualität und langfristige Verfügbarkeit ist oft nicht vorhersehbar bzw. sichergestellt. Es kann öfter sogar bis zu Jahren dauern bis geeignete Antikörper und ein effektiver Quantifizierungs-Assay entwickelt ist. Im Fall einer Punktmutation in einer Proteinsequenz sind sogar oft keine spezifischen Antikörper zu erhalten, die eine zuverlässige Quantifikation von Wildtyp und Mutante erlauben würden.

Picture: Selected Reaction Monitoring (Mass Western) - Auswahl geeigneter Aminosäuresequenzen für isotopenmarkierte heavy peptide Standards

Absolute Quantifizierung mit SRM

Selected Reaction Monitoring (SRM, Mass Western) erlaubt die absolute Quantifikation von Proteinen und Peptiden bereits nach kurzem bis mittelfristigem Entwicklungs- und Zeitaufwand, indem isotopenmarkierte (13C, 15N markierte) Standardpeptide synthetisiert werden, die nur für das zu quantifizierende Peptid oder Protein in der SRM LC-ESI-MSMS Analyse charakteristisch sind (sogenannte Signaturpeptide). Innerhalb kurzer Zeit läßt sich dann ein spezifischer SRM LC-ESI-MSMS Assay für die Quantifizierung entwickeln. Die Nachweisgrenze liegt meist im unteren Femtomolbereich mit einem linearen dynamischen Meßbereich von bis zu ca. 3-4 Größenordnungen.
(Wienkoop and Weckwerth, 2006; )

Mittels des massenspektrometrischen Ansatzes lassen sich auch gezielt Punktmutationen in Proteinen erfassen und das Verhältnis zwischen Mutante und Wildtyp quantifizieren. So z.B. auch bei der Arbeit von E. Becker et al. (2007), bei der Proteome Factory massenspektrometrische Analysen durchgeführt hat (siehen Abstract unten).

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Drug target discovery in low abundance proteins
Wienkoop and Weckwerth
DPi - September 2006
Many potential key target proteins are overshadowed by high abundance proteins and therefore identification and quantification is extremely difficult. This article describes a new stable isotope
labelling system, which has been used in a novel (shotgun) proteomic process to provide relative and absolute quantification of a low abundance protein.


Quantification of Mutant versus Wild-Type Myosin in Human Muscle Biopsies Using Nano-LC/ESI-MS
Edgar Becker, Francisco Navarro-Lopez, Antonio Francino, Bernhard Brenner, and
Theresia Kraft
Anal. Chem.2007, 79,9531-9538
A liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (nano-LC/ESI-MS) approach is described by which abundance of proteins (e.g., of â-myosin heavy chain; MW 223 kDa) carrying a point mutation can be determined in tissue samples where the mutant protein is coexpressed with its wild-type forms. After enzymatic cleavage of the extracted parent protein, mutant and wildtype species of the peptide with the locus of the point mutation were quantified. Synthetic peptides, identical to wild-type and mutant peptides but labeled with stable isotopes (13C, 15N), were added in known amounts as internal standards. The peak areas obtained by MS for the stable-isotope-labeled peptides and for the native
peptides were used for quantification. To demonstrate the suitability of this approach we determined the relative abundance of â-myosin with the Arg723Gly exchange in muscle biopsies of patients with Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM). For two such patients the fraction of mutated myosin was 62%, i.e., significantly different from 50%, which is quite unexpected for an autosomal dominant disease in heterozygous patients. Correlation between abundance of mutant myosin and clinical malignancy seen for several mutations in the myosin head domain emphasizes the relevance of such quantification. The approach for quantification described here is generally applicable for quantification of proteins with single
point mutations even if only small amounts of tissue are available.


Picture: Workflow der absoluten Quantifiziwerung mit SRM -